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面向世界科技前沿,面向國家重大需求,面向國民經濟主戰場,率先實現科學技術跨越發展,率先建成國家創新人才高地,率先建成國家高水平科技智庫,率先建設國際一流科研機構。

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深海微生物原位采樣新技術及應用

2021-12-09 深??茖W與工程研究所
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  深海是由高壓和低溫組成的極端環境,并存在熱液、冷泉、泥火山、鹽鹵池等特殊生境。由于光線無法到達,深海生態系統被稱為為以化能自養微生物為生命基礎的“暗世界”?;谏詈I飳W研究在揭示生命起源與演化機制、解析全球碳氮元素循環過程以及尋找新的天然活性產物和工程酶類方面的重要意義和價值,越來越多科學研究人員將目光投向深海,并開展了一系列前沿性的深海探索項目。

  作為海洋中最高豐度和生物量的生命形態,海洋微生物在碳、氮、硫等關鍵元素循環方面發揮重要作用,是生物地球化學循環過程中重要的一員,因而成為海洋前沿科學研究的專注點之一。然而,受限于微生物培養技術條件的不足,實驗室可培養的微生物種類有限,由于受壓力、溫度、原位物質能量特征等因素的影響深海來源的微生物更是難以培養。因此,對微生物的研究極度需要非培養依賴性的技術手段。目前,科研人員利用DGGE電泳、16S rRNA文庫以及454焦磷酸法測序等手段,已對環境微生物的群落結構有了比較深入的認識。近年來,高通量測序技術的快速發展,更讓科學家得以從宏基因組學和宏轉錄組學水平解析環境微生物的功能特征。宏基因組學是從DNA水平上對環境微生物所攜帶的功能特征基因進行分析。宏轉錄組學則是從RNA水平上反應微生物的原位基因表達情況,可以更真實的揭示環境微生物的活性狀態,逐漸成為環境微生物學研究的發展趨勢。

  相對于DNA分子,RNA易于降解,其半衰期一般僅有幾分鐘(Steglich et al., 2010),這對如何獲取真實反映微生物原位表達活性的轉錄組數據構成挑戰。對于深海微生物取樣而言,常規手段是通過Niskin取樣瓶采集海水樣品,將樣品收回到船上后進行過濾收集和固定處理,這種取樣方式存在較多不足,從深海取樣采集到回收至甲板上一般需耗時幾十分鐘至數小時不等,樣品回收過程中壓力、溫度,及溶氧量等諸多環境因素的變化,將影響微生物的活性狀態,致使獲取的深海微生物樣品無法真實反映其深海原位的基因表達情況。采用合適的裝備,對深海樣品進行原位富集過濾,并進行原位固定取樣成為解決這一問題的關鍵。

  關于深海原位微生物取樣技術,國外已開展了相關的研發工作。

  因應深??茖W研究的需求,中國科學院深??茖W與技術研究所設計了一套依托于著陸器的自動化深海微生物原位富集與固定取樣器(ISMIFF)。該取樣器是一套可在深海及深淵環境(深度大于6000的深海海域)下進行水體微生物原位富集過濾并將其生物信息即時固定的裝置。該裝置由控制艙和過濾艙兩個艙體組成??刂婆撌且粋€充油補償艙,包含控制電路板、泵、閥以及壓力傳感器等,過濾艙則主要用于放置生物濾膜。該裝置搭載于著陸器進行作業,由著陸器提供能源,并通過串口與著陸器進行通訊。

  ISMIFF的作業流程圖1所示。作業開始前,需將裝置內的管路清洗并充滿無菌水。著陸器坐底后,為避開浮塵影響,延時0.5-2小時后向富集裝置發送運行指令,富集裝置控制泵開始運轉,將海水泵入含有0.22 μm生物濾膜(用于截留微生物)的過濾艙中。裝置內的壓力傳感器實時監控過濾管路中的液體壓力,根據壓力反饋控制泵的輸出功率,從而使管路中液體壓力保持在合理范圍。當富集裝置過濾海水體積達到預設置后,通過電磁閥切換試劑管路,將固定液注入過濾艙,以實現樣品原位固定。著陸器回收后,立即在實驗室進行濾膜樣品的處理與保存。

  ISMIFF可最大程度實現原位保真取樣。該取樣器在過濾水體總量方面具有優勢,濾水初始流速高達700 ml/min,實際測試中7小時內完成約300 L海水的原位過濾,遠大于船載CTD采水器一次下作業的采水量240 L,為在深海及深淵寡營養環境低豐度微生物樣品的獲取提供了便利。ISMIFF已完成121MPa(1萬米海水深度1.2倍的壓力值)的嚴格打壓測試,可實現全海深原位取樣,擴展了應用范圍。

  ISMIFF首先在深海所執行的馬里亞納深淵科考航次中進行了實驗性應用??茖W家采集了挑戰者深淵序列深度的水體微生物原位樣品,運用宏基因組測序,解析深淵原位條件下的水體微生物群落組成,結果表明原位條件下的微生物群落組成與常規Niskin采水瓶采集的樣品具有差異(Wang et al. 2019)?;谛碌幕蚪M分揀技術,研究人員亦獲取了30個深淵微生物類群的高質量基因組序列,闡明了與氮硫相關的元素循環過程和轉錄活性特征,并闡釋了Chloroflexi和Marinimicrobia分別在深淵難降解型有機物和蛋白類有機物的代謝方面所發揮的重要作用(圖2;Gao et al. 2019)。該研究是中國科學家首次剖析深淵微生物基因組并報道其原位代謝活性,揭示深淵特殊極端環境對微生物種群分化的驅動作用。另外,此研究還表明深淵特定微生物類群可能通過氧化CO來獲取能量,拓展了CO氧化菌的已知生存空間范圍(Gao et al. 2019)。

  在國家重點研發計劃專項課題“冷泉系統生物演化及適應機制”的支持下,ISMIFF在海底冷泉微生物原位取樣方面也取得了進展。在2019年5月、2020年5月,廣州海洋地質調查局“海洋地質六號”科考船的南海冷泉航次中,ISMIFF搭載“海馬”號ROV,于海馬冷泉區不同站位開展了底棲生物幼蟲及水體微生物的富集和原位固定取樣(圖3)。2021年1月,深海所“探索二號”船執行的海南科考航次中,科學家借助“深海勇士”號載人潛水器將ISMIFF直接布放海底,進行了多位點的原位固定取樣(圖4)。應用ISMIFF進行海底采樣不僅能夠大幅增加過濾水體的體積,減少工作量,而且可以實現樣品原位固定,可以更好地服務于深海冷泉生態系統的科學研究。

圖1.深海微生物原位富集與固定取樣器及作業流程圖

圖2.深淵水體微生物生態角色全面解析

圖3.ISMIFF原位取樣器借助“海馬”號ROV在進行海底原位取樣

圖4.ISMIFF原位取樣器直接布放于海底冷泉區進行原位取樣

打印 責任編輯:侯茜

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